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ELISA試劑盒測定辦法的標(biāo)準(zhǔn)化-晶抗生物
更新時間:2020-01-10   點擊次數(shù):1441次

要使ELISA試劑盒測定得到的作用,不論是定性的仍是定量的,有必要嚴(yán)峻依照規(guī)矩的方法制備試劑和施行測定。

首要試劑的制備要害已如前述,其他一般性試劑,如包被緩沖液、洗刷液、標(biāo)本稀釋液、結(jié)合物稀釋液、底物工作液和酶反應(yīng)中止液等,制作時不可漫不經(jīng)心。

緩沖液可于冰箱中短期保存,運用前應(yīng)查詢是否蛻變。蒸餾水的質(zhì)量在ELISA中也至關(guān)重要,運用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。

測定的施行中,應(yīng)力求各個過程操作的標(biāo)準(zhǔn)化,下面以板式ELISA為例,介紹有關(guān)留心事項。

(一)ELISA實驗加樣

在ELISA中除了包被外,一般需進(jìn)行45加樣。在定性測定中有時不強(qiáng)調(diào)加樣量的性,例如規(guī)矩為加樣一滴。此刻應(yīng)該運用相同口徑的滴管,堅持的加樣姿勢,使每滴液體的體積底子相同。在定量測定中則加樣量應(yīng)力求。

標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)矩制作。加樣時應(yīng)將液體加在孔底,防止加在孔壁上部,并留心不可出現(xiàn)氣泡。

(二)ELISA實驗保溫

在ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng),即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后,此刻反應(yīng)的溫度和時刻應(yīng)按規(guī)矩的要求,保溫容器是水浴箱,可使溫度迅速平衡。各ELISA板不該疊在一同。為防止蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋,或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。

濕盒應(yīng)該是金屬的,傳熱簡略。如用保溫箱,空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其間,以平衡溫度,這在室溫較低時更為重要。參與底物后,反應(yīng)的時刻和溫度一般不做嚴(yán)峻要求。如室溫高于20℃,ELISA板可避光放在實驗臺上,以便不時查詢,待對看管顯色適當(dāng)時,即可中止酶反應(yīng)。

(三)ELISA實驗洗刷

洗刷在ELISA過程中不是反應(yīng)聚,但卻是決定實驗成敗的要害。洗刷的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的煩擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。

因此在ELISA測定的反應(yīng)過程中應(yīng)盡量防止非特異性吸附,而在洗刷時又應(yīng)把這種非特異性吸附的煩擾物質(zhì)洗刷下來。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗刷液中參與聚山梨酯(吐溫,Tween)一類物質(zhì)即右到達(dá)此目的。

聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯,為非離子型的表面張力物質(zhì),常作為助溶劑。依據(jù)脂肪酸的品種而對聚山梨酯編號,結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20,在ELISA中zui為常用。它的洗刷作用好,并具有削減非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。

洗刷如不*,特別在zui后一次,如有酶結(jié)合物的非特異性吸附,將使空白值升高。其他,在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈,也將與酶標(biāo)抗體作用而發(fā)作煩擾。

ELISA板的洗刷一般可采用以下方法:①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液;②將洗刷液注滿板孔;③放置2min,略作搖擺;④吸干孔內(nèi)液,也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗刷的次數(shù)一般為3~4次,有時甚至需洗5~6次。

(四)ELISA實驗比色

如陰性對照色彩極淺,在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定作用,性決定于ELISA板底的平坦與透明度和比色計的質(zhì)量。

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